सदस्य वार्ता:Faaiza1840726/प्रयोगपृष्ठ
पॉलिमरेज चेन श्रृंखला का अर्थ पॉलिमरेज चेन रिऐक्शन (PCR) निश्चित DNA अनुक्रम की हजारों से लाखों प्रतियां उत्पन्न करने के लिये, मैग्गींटयूड के कई आर्डरों के विपरीत DNA के अंशों को एक या कई प्रतियाँ बढ़ाने के लिये मॉलेकुलर बॉयोलाजी में वैज्ञानिक तकनीक है । यह विधि थर्मल साइकिलिंग पर निर्भर होती है । DNA पिघलन एवं DNA के एन्जाइमेटिक प्रतिकृति के लिये रियेक्शन के बार-बार गर्म एवं ठंडा होने के चक्र को शामिल करती है ।
DNA पॉलिमरेज (जिसके पश्चात विधि को नाम दिया जाता है) के साथ टारगेट क्षेत्र तक संपूरक निश्चित क्षेत्र तक अनुक्रमों को शामिल करके प्रवेशिकायें (छोटे DNA खण्ड) चयनात्मक एवं विस्तार को समर्थ बनाने के लिये महत्त्वपूर्ण घटक होते है । जैसे ही PCR विकसित होता है । उत्पन्न DNA स्वयं प्रतिकृत के लिये टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है । ज्यादातर सभी PCR अनुप्रयोग गर्म-स्थिर DNA पॉलिमरेज DNA का उपयोग करते है । जैसे टैक पॉलिमरेज बैक्टीरियम थर्मस एक्वाटिकस से वास्तविक रूप से अलग एन्जाइम । यह DNA पॉलिमरेज एन्जाइमेटिकली टेम्पलेटट एवं DNA (प्रवेशिकायें भी कही जाती है ।) ऑलिगो न्यूक्लियोटाइड के, रूप में अलग स्ट्रेन्डिड का उपयोग करके न्यूक्लियोटाइड DNA बिल्डिंग ब्लॉक से नये DNA एकत्रित करता है जो DNA संयोग के प्रारंभ के लिये आवश्यक होते है । PCR विधियों की व्यापक प्रमुखता थर्मल साइकिलिंग का उपयोग करती है अर्थात् तापमान चरण की निश्चित संख्या तक PCR सैंपल को वैकल्पिक रूप से गर्म एवं ठण्डा करना । ये थर्मल साइकिलिंग चरण DNA पिघलन नामक प्रक्रिया में उच्च तापमान तक दोहरी कुण्डली DNA में ये स्ट्रेडिडों के भौतिक रूप से अलग करने के लिये सर्वप्रथम आवश्यक होते है । निम्न तापमान पर टारगेट DNA के चयनात्मक विस्तार के लिये DNA पॉलिमरेज द्वारा DNA के संयोग में फिर प्रत्येक स्ट्रेड टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है ।
प्रवेशिका के उपयोग के परिणाम से उत्पन्न चयनात्मकता जो विशिष्ट थर्मल साइकिलिंग स्थितियों के अंतर्गत विस्तार के लिये निश्चित DNA क्षेत्र हेतु संपूरक होती है । पॉलिमरेज चेन श्रृंखला के सिद्धांत एवं प्रक्रिया [Principle and Process of Polymerase Chain Reaction (PCR)]: DNA स्ट्रेड (DNA टारगेट) के विशेष क्षेत्र को बढ़ाने के लिये PCR का उपयोग किया जाता है । ज्यादातर PCR का विधियाँ विशिष्ट रूप से DNA के अंशों को 10 किलोबेस पेयर (kb) तक विस्तृत करती है । यद्यपि कुछ तकनीकों अंशों को आकार में 40 kb तक विस्तार की अनुमति देती है । आधारभूत PCR सेटअप को कई घटकों एवं प्रतिक्रियाशील तत्वों की आवश्यकता होती है
ये घटक निम्न को शामिल करते है: (a) DNA टेम्पलेट, जिसमें विस्तृत किया जाने वाला DNA क्षेत्र (टारगेट) शामिल होता है ।
(b) दो प्रवेशिका जो दृष्टि की प्रत्येक समष्टि एवं DNA टारगेट की विपरीत दृष्टि स्ट्रेड से 3 इंच (3 मुख्य) तक संपूरक होती है ।
(c) लगभग 70°C पर उचित तापमान के साथ टेक पॉलिमरेज अन्य कोई DNA पॉलिमरेज ।
(d) डिऑक्सीन्यूक्लियोसाइड ट्रिफॉस्फेट (ट्रफॉस्फेट समूह को मिलाकर dNTPs न्यूक्लियोटाइड) बिल्डिंग ब्लाक, जिसमें DNA पॉलिमरेज तथा DNA स्ट्रेड एकत्र करता है ।
(e) DNA पॉलिमरेज की उचित गतिविधि एवं स्थिरता के लिये उचित के वातावरण प्रदान करके बफर साल्युशन ।
(f) डाइवलेट केटायन, मैग्नीशियम या मैनग्रेनेज अर्थात्, सामान्यतः Mg2+ उपयोग किया जाता है । क्योंकि उच्च Mg2+ DNA एकत्रीकरण के दौरान अशुद्धि दर में वृद्धि करता है ।
(g) मोनोवैलेंट केटायरन पोटेशियम आयन्स ।
PCR सामान्तया थर्मल साइकलन में छोटी रिऐक्शन ट्यूब में (0.2-0.5ml वाल्यूम) में 10-20ul की रियेक्शन मात्रा में संचालित किया जाता है । थर्मल साइकलर रियेक्शन के प्रत्येक चरण पर आवश्यक तापमान प्राप्त करने के लिये रिऐक्शन ट्यूब को गर्म या ठंडा करता है ।
कई आधुनिक थर्मल साइकलर पेल्टियर प्रभाव का उपयोग करें हैं, जो इलेक्ट्रिक कटेंट को सरलता से वापिस करके PCR ब्लाक होल्डिंग को गर्म एवं ठंडा करने की अनुमति देता है । पतली दीवार रियेक्शन ट्यूब लगातार थर्मल समानता के लिये अनुमति देने हेतु उचित थर्मल संचालन की अनुमति देता है
अधिकतर थर्मल साइकलर ने रिऐक्शन ट्यूब के सिरे पर संक्षिप्तीकरण को रोकने के लिये लिड्स को गर्म किया है । पुराने रिमो साइकलर में रिऐक्शन मिश्रण के सिरे पर या ट्यूब के अंदर बाक्स की दीवार पर आयत की परत के लिये आवश्यक गर्म लिड की कमी होती है ।
पॉलिमरेज चेन श्रृंखला के साइकल का व्यवस्थित चरण
(1) 94-96°C पर अप्राकृतिक । (2) 65°C पर गर्म करना । (3) 2°C पर दीर्घीकरण । यहाँ चार साइकल प्रदर्शित किये जाते हैं । नीली रेखा DNA टेम्पलेट को प्रदर्शित करती है, जिस तक प्रवेशिका (ला ऐरो) दीर्घ होते है, जो छोटे DNA प्रोडक्ट (हरी रेखा) देने के लिये DNA पॉलिमरेज (लाइट ग्रीन सर्कल) द्वारा विस्तृत होते है, जो स्वयं टेम्पलेट के रूप में उपयोग किये जाते है, जैसे ही PCR विकसित होता है । महत्त्वपूर्ण रूप से PCR बार-बार तापमान परिवर्तन, साइकल कहा जाता है । प्रत्येक साइकल के साथ सामान्य रूप से 2-3 अलग-अलग तापमान चरण अक्सर तीन को शामिल करके 20-40 की संख्या को सम्मिलित करती है ।
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